微生物鑒定質(zhì)譜儀通過測量帶電粒子在電場或磁場中的運動來確定其質(zhì)量與電荷比（m/z）。具體到MALDI-TOFMS，它通過激光使樣品中的分子解吸和電離，然后測量這些離子飛行時間（TOF）以確定其m/z。由于不同微生物的蛋白質(zhì)圖譜，因此可以利用這些圖譜進(jìn)行微生物的鑒定和分類。
樣品制備
1.純培養(yǎng)物的獲取：為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，首先需要從臨床樣本中分離出純培養(yǎng)物。這通常通過在選擇性培養(yǎng)基上單菌落分離來實現(xiàn)。
2.樣品處理：取少量純培養(yǎng)物，用于質(zhì)譜分析。具體步驟包括：
-直接轉(zhuǎn)移法：將菌落直接轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜靶板上。
-提取法：對于一些難以直接分析的菌種，可以先進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。例如，革蘭氏陰性菌可以用乙醇-甲酸進(jìn)行簡單提取。
3.基質(zhì)添加：在樣品上加入基質(zhì)（如α-氰基-4-羥基肉桂酸），基質(zhì)在激光照射下幫助樣品分子解吸和電離。
質(zhì)譜分析
1.儀器校準(zhǔn)：使用已知標(biāo)準(zhǔn)品對微生物鑒定質(zhì)譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保測量的準(zhǔn)確性。
2.數(shù)據(jù)采集：將準(zhǔn)備好的樣品靶板放入質(zhì)譜儀，設(shè)定適當(dāng)?shù)募す鈴姸群推渌麉?shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
3.數(shù)據(jù)處理：生成的原始數(shù)據(jù)通常是一個復(fù)雜的譜圖。通過專門的軟件將這些譜圖轉(zhuǎn)換為可識別的蛋白質(zhì)圖譜。
數(shù)據(jù)分析與解釋
1.數(shù)據(jù)庫匹配：利用數(shù)據(jù)庫中的參考譜圖對樣品的質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配。當(dāng)前市面上有許多商業(yè)化的微生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，如MALDIBiotyper和VITEKMS。
2.判定標(biāo)準(zhǔn)：匹配結(jié)果根據(jù)相似度得分進(jìn)行判斷。通常，得分越高，匹配越準(zhǔn)確。各公司提供的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫都有自己的得分閾值，超過該閾值即可認(rèn)為鑒定結(jié)果可靠。
3.結(jié)果驗證：對于罕見或鑒定結(jié)果不明確的菌種，可以通過16SrRNA基因測序等方法進(jìn)一步驗證。
注意事項與常見問題
1.樣品純度：混合菌樣品可能導(dǎo)致質(zhì)譜圖復(fù)雜化，影響鑒定準(zhǔn)確性。因此，確保樣品純度至關(guān)重要。
2.儀器維護(hù)：定期校準(zhǔn)和維護(hù)儀器，以保證其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
3.數(shù)據(jù)庫更新：持續(xù)更新質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，以包含新的微生物譜圖，提高鑒定的覆蓋廣度和準(zhǔn)確度。
